Principios de la prueba de lisado de amebocitos de Limulus (LAL) para la detección de endotoxinas bacterianas

La prueba LAL o Limulus se utiliza para la determinación de endotoxinas bacterianas en una amplia variedad de muestras en los laboratorios de investigación e industrias. El principio de esta prueba se

basa en el proceso de la coagulación que se produce en la hemolinfa de cangrejo de herradura (Limulus polyphemus) en presencia de lipopolisacáridos. En este artículo, se describe el proceso biológico y la forma en que se utilizó para desarrollar la prueba.

La coagulación de la hemolinfa del cangrejo de herradura se produce a través de una serie de reacciones en cadena similares a los observados en los mamíferos. Para que se activen estas reacciones en cadena las pro-enzimas serina proteasas, presentes en la hemolinfa, necesitan reaccionar sucesivamente para hacer causar el proceso de gelificación. Un rasgo característico de la reacción de coagulación que ocurre en el cangrejo Limulus es que se activa con muy pequeñas cantidades lipopolisacáridos (LPS); concentraciones a nivel de picogramos de endotoxinas bacterianas que entran en contacto con la hemolinfa ya son suficientes para que la reacción se produzca. Estas reacciones de coagulación tienen la función de inmovilización de microorganismos patógenos, que mueren debido a las sustancias antimicrobianas secretadas en paralelo y liberados en la hemolinfa.

El hecho de que muchos de los precursores necesarios para la formación de coágulos en la hemolinfa del cangrejo de herradura, se encuentran en la hemolinfa en forma de gránulos, conocidos como amebocitos, fue utilizado por los investigadores al desarrollar un método de análisis de endotoxinas bacterianas mediante la extracción de la hemolinfa del cangrejo. Esta prueba se conoce como el lisado de amebocitos de Limulus (LAL). El lisado de los gránulos se realiza precisamente para que reaccionen a la presencia de endotoxinas en el entorno de prueba y se produzca la gelificación. La gelificación es la señal analítica utilizada tanto para la detección cualitativa y cuantitativa de LPS. Para realizar la prueba, una cantidad de hemolinfa de cada cangrejo se extrae con una jeringa y el animal se devuelve a su entorno.

Destacado: La detección de endotoxinas a través de la prueba de LAL, el Método de formación de Gel

Si vamos más profundo en el proceso biológico que se produce en la hemolinfa del cangrejo de herradura en presencia de LPS, se puede ver una serie de procesos de activación separadas de proenzimas a enzimas proteolíticas:

– LPS activa la reacción autocatalítica del factor pro-enzima C, en su transformación a factor activado C;

– El factor C, a su vez, activa el factor de B;

– El factor B convierte la pro-enzima formadora de gel en una enzima.

La enzima de coagulación resultante es responsable del anclaje de las dos unidades peptídicas en la coagulación, formando un gel insoluble. Esta molécula es similar a fibrinógeno en los artrópodos.

La cadena de coagulación descrito anteriormente también se activa por la (1,3) -β-D-glucano, en este caso a través de la activación del factor G, que es otra pro-enzima serina proteasa y que también conduce a la formación de la enzima formadora de gel. Por lo tanto, la β-D-glucano se considera que es un agente de interferencia en el ensayo de LAL, para la medición de endotoxinas. Los investigadores de Wako estudiaron si la interferencia de la (1,3) -β-D-glucano se elimina cuando se añade curdlan en el medio de reacción. Los reactivos de Wako incorporan curdlan carboximetilado en la mezcla de los reactivos liofilizados, tanto en los reactivos ES-F de Limulus y la serie Pyrostar PS, asegurando resultados fiables para la determinación de LPS.

Podemos confirmar que la prueba LAL es un simple método de prueba que es muy sensible a las endotoxinas bacterianas, y que se utiliza actualmente como la prueba más eficaz para la determinación de tales sustancias. El método original utilizado para llevar a cabo de una manera cualitativa o semi-cuantitativa: la presencia de endotoxinas se determinó mediante la lectura de la formación de coágulos de gel después de la incubación de una muestra con lisado de amebocitos a 37ºC durante 1 hora. En la actualidad, se han desarrollado métodos cuantitativos altamente eficientes, que nos permiten conocer la cantidad exacta de endotoxinas bacterianas en una muestra, por ejemplo, la prueba clave de Limulus Color KY, que se basa en el método colorimétrico.

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