Montar un biorreactor no es tarea sencilla. ¿Calibro los sensores antes o después de autoclavar? ¿Tengo que cubrir todos los filtros con papel de aluminio? Estas son solamente algunas de las preguntas que pueden surgir cuando preparamos nuestro biorreactor para el próximo cultivo. En esta nota, le guiaremos paso a paso en el montaje y preparación del biorreactor para que pueda comenzar un bioproceso exitoso.
En los siguientes párrafos describiremos todo el trabajo necesario antes de comenzar el proceso de cultivo en un biorreactor de mesada:
Montaje del vaso de cultivo
Instalación y calibración de sensores
Autoclavado del vaso
Adición del medio de cultivo y preparación para iniciar el bioproceso
Inoculación del biorreactor
Control del bioproceso
Después del bioproceso
1. Montaje del vaso de cultivo
Verifique que el vaso esté sano y que todos los o-rings y sellos están intactos y posicionados correctamente
Instale, conecte y asegure todos los sensores, entradas de gas, reactivos y puertos para muestreo o cosecha, según lo requerido por su bioproceso.
Una vez que el biorreactor ha sido autoclavado, cualquier cambio deberá realizarse cuidadosamente dentro de una cabina estéril.
Verifique la altura de los impulsores y su sujeción al eje. Para evitar la formación innecesaria de espuma, no coloque el impulsor a la misma altura que la superficie del medio de cultivo.
Inserte los baffles (si corresponde)
Verifique que el o-ring de la tapa esté sano y correctamente posicionado.
Inspeccione los o-rings de todos los componentes instalados en la tapa, ya sean puertos de entrada, sensores o tapones ciegos.
Verifique la altura y posición correcta de todos los elementos con altura ajustable, tales como tubos de inmersión. El sparger debería estar inmediatamente por debajo del eje de agitación.
Llene el vaso con medio de cultivo estable a la temperatura o agua (aprox. 10 mL de agua por cada litro de volumen total del vaso) para asegurar el desarrollo de vapor y una esterilización efectiva
Coloque la tapa del vaso y alinéela correctamente. Asegúrese de que las partes instaladas y baffles no se tocan entre sí.
Ajuste las tuercas de la tapa manualmente (no utilice herramientas).
2. Instalación y calibración de sensores
Luego de asegurar todas las piezas mecánicas y la tapa del vaso, los puertos para los sensores siguen abiertos. Normalmente se instalan al final, ya que son más susceptibles al daño mecánico. Antes del bioproceso, deben ser calibrados.
Cada laboratorio suele tener sus propios protocolos para realizar estos pasos, por lo que algunos detalles pueden diferir.
En general, la sonda de pH se calibra como cualquier pHmetro, antes de la instalación y antes de autoclavar. Utilice 2 buffers de referencia que cubran el rango de operación esperado, por ej. pH 4 y 7.
Las sondas de pO2 y sensors de turbidez opcionales se calibran después del autoclavado, debido a que dependen de las condiciones de operación reales.
Para otros sensores, por favor consulte el manual del fabricante.
Pasos:
Instale el sensor de pO2 en el biorreactor.
Opcional: Instale el sensor de turbidez
Conecte el sensor de pH a la unidad de control, pulse la opción de calibración y siga las instrucciones del display.
Desconecte el sensor de pH de la unidad de control e instálelo en el biorreactor.
3. Autoclavado del biorreactor
Prepare las botellas de reactivo. Nota: No todos los reactivos son esterilizables en autoclave (ej.: solución de amoníaco, sustratos que pueden caramelizarse, etc.). Si este es el caso, para autoclavar, rellene las botellas con agua. Luego de autoclavar, reemplace el agua por el reactivo correspondiente (dentro de una cabina estéril).
Desmonte el panel de bombas peristálticas de la unidad de control y colóquelo en el gancho correspondiente en la jaula del vaso.
Conecte las mangueras desde las botellas de reactivo a los cabezales de bomba, y desde estos cabezales a las agujas de inoculación de la tapa del vaso; asegure las conexiones.
Conecte el muestreador Super Safe Sampler al tubo de muestreo, clampear y cubrir con papel de aluminio.
Si no están colocados, conecte el/los filtro/s de aire.
De corresponder, conecte todos los tubos adicionales (ej.: de cosecha, etc.) y pínzelos con el clamp.
Cubra el filtro ligeramente con papel de aluminio. Deje el filtro de escape abierto y ¡no lo pinze bajo ninguna circunstancia! Esto es esencial para el balance de la presión durante el autoclavado.
Coloque el vaso, contenido dentro de su jaula, con todos los periféricos conectados, dentro de la autoclave y esterilice de acuerdo con el procedimiento estándar de su laboratorio (ej.:121 °C por 20 a 30 minutos).
4. Adición del medio y preparación para el cultivo
¿Qué falta hacer? Conectar el vaso a la unidad de control, posiblemente llenar con medio de cultivo y calibrar los sensores restantes.
Pasos:
Posicione la jaula del vaso en la unidad de control. Conecte el control de temperatura (a través del doble encamisado o instale la manta calefactora, según corresponda -por favor, consulte las instrucciones del manual-).
Coloque el panel de bombas peristálticas, montando los cabezales en sus ejes en la unidad de control.
Llene las mangueras con los reactivos correspondientes (para evitar fallas en la unidad de control por aspiraciòn de aire).
Conecte los sensores de espuma, pH, pO2 y turbidez en la unidad de control.
Inserte el sensor de temperatura dentro del manguito correspondiente en la tapa del vaso. Empuje hacia abajo hasta que escuche el contacto metal con metal.
Acople el motor de agitación
Conecte las líneas de gas y el exit gas cooler.
Si no fue autoclavado junto con el vaso, dispense el medio de cultivo utilizando un proceso de filtrado estéril.
Encienda el biorreactor, active la agitación y el control de temperatura, seteados en los valores de operación deseados.
Una vez alcanzados dichos valores, puede que deba reajustar el sensor de pH o el pH del medio. Calibre el sensor de pO2 y grabe el valor cero para el sensor de turbidez.
5. Inoculación del biorreactor
Aunque el proceso depende de cada caso individual, los pasos generales son:
Deje el equipo andando con medio de cultivo sin inocular por 24 horas para que las condiciones del vaso se estabilicen
Prepare el inóculo (por ej., de un frasco Erlenmeyer precultivado en una incubadora shaker).
El proceso para inocular microorganismos es bastante simple: puede introducir el inóculo por medio de una jeringa, pinchando la membrana del puerto de inoculación. Puede desinfectar la membrana con solución de alcohol o trabajar cerca de llama. Sin embargo, nunca tendrá 100% de garantías contra la contaminación.
El riesgo de contaminación en cultivos de células eucariotas es mayor: el inóculo debe introducirse a través de una conexion estéril, ya sea dentro de una cabina estéril o creado localmente cerca del biorreactor (por ej., con un soldador de mangueras).
Si está disponible, presione el botón de inoculación en el bioreactor o en el software SCADA para arrancar el bioproceso -y dar curso a cualquier estrategia programada previamente-.
6. Control del bioproceso
En general, el crecimiento de los microorganismos se ve limitado tan pronto como algún factor esencial se vuelve limitante. Por ej., si la tasa de crecimiento se ve limitada por oxígeno insuficiente, se incrementará si proveemos más oxígeno hasta que este u otro factor produzcan un efecto limitante. Seleccionar la estrategia correcta le permitirá optimizar el diseño de su bioproceso, mientras maximiza la eficiencia en términos de producto y tiempo. Para conocer más sobre las diferentes estrategias de alimentación, puede visitar nuestro post: Diferencias entre batch, fed-fatch y cultivo continuo (próximamente).
7. Después del bioproceso
Luego del bioproceso, tendrá que descontaminar y limpiar el biorreactor para el próximo cultivo. Cada institución tiene diferentes protocolos sobre cómo matar los organismos. Esto se puede realizar autoclavando el vaso y luego descartando el caldo de cultivo, lo que usualmente involucra procesos de limpieza posteriores más complejos para el vaso y sus periféricos.
Alternativamente, puede matar de manera separada el caldo de cultivo cosechado. Descontamine y limpie el biorreactor y las superficies que hayan estado en contacto con los organismos.
En conclusión, montar un biorreactor para un cultivo exitoso sin contaminación no es tarea fácil. Por este motivo, los fabricantes de biorreactores buscan optimizar y reducir los pasos necesarios para iniciar su bioproceso de la forma más rápida y sencilla posible. Esperamos que la información presentada aquí le ayude a acelerar el proceso. ¡Muchos éxitos en su próximo cultivo!
